Go Back   Diễn đàn Sinh học Việt Nam > Phòng thí nghiệm > Làm thí nghiệm với acid nucleic

Làm thí nghiệm với acid nucleic Tách chiết, đo OD, điện di, cắt giới hạn, ligation, biến nạp, cloning, blotting...

Trả lời
 
Ðiều Chỉnh Xếp Bài
Old 24-08-06, 19:11   #1
Trần Hoàng Dũng
Registered Users
 
Trần Hoàng Dũng's Avatar
 
Tham gia ngày: Aug 2004
Bài gửi: 2,036
Thanks: 0
Thanked 37 Times in 32 Posts
TO HÀ,

Tui thành thật xin lỗi là đã mang vấn đế bạn hỏi ra trước bàn dân thiên hạ, đơn giản là khi tui reply cho bạn, forum cho biết

Thông báo

Không có tên người nhận trong danh sách thành viên



Trích:
Nguyên văn bởi Nguyễn Lê Bảo Thu Hà
Chào anh Dũng,

Em mới vào diễn đàn thôi. Em hiện đang làm PCR trên nấm, không chạy, định vào diễn đàn hỏi, nhưng thấy cũng đã có người thắc mắc như thế rồi, và được biết là anh cũng đã từng làm cà ngàn PCR như anh nói, nên em viết hỏi anh riêng, đỡ mất công tạo thêm một cái topic thừa trên diễn đàn.

Nấm em đang sử dụng là Caldariomyces fumago. Em lấy mẫu từ culture, sau đó đem rửa qua nước vài lần và cuối cùng là cho vào sonifier để phá hủy tế bào, cốt là chỉ lấy DNA thôi. Sau đó, em đem nấu 95°C 20', rồi đem ra sử dụng cho PCR.

Máy PCR ở chỗ em là loại Gradient Cycler, em thử các nhiệt độ bắt cặp khác nhau, lúc thì 45-55°C, lúc thì 50-70°C, em dùnh cả Touchdown-HotStart-PCR mà vẫn không có kết quả. Người hướng dẫn em cách đây một năm cũng làm với loại nấm này, cũng cách như em vừa kể trên thế mà được. Tóm lại, em cũng không biết tại sao PCR không chạy nữa. Nếu nói là phương pháp sai sao có người làm được (người hướng dẫn em đã làm được). Còn nồng độ thì em vẫn thường làm PCR với nồng độ như thế, chẳng bào giờ bị làm sao cả.

Anh nghe kể bệnh rồi, với kinh nghiệm làm PCR nhiều, anh có thể tiết lộ vài "bí quyết" được không?

Cảm ơn anh trước.

Hà.

Tui đang suy nghĩ bệnh của bạn rất có thể là do kỹ thuật tách DNA chưa ổn.

Nhưng mà tui khuyên bạn cứ mạnh dạn mang vấn đề ra trước SHVN, sẽ có nhiều người cùng giúp, riêng bản thân tui hứa sẽ tra cứu vấn đề để giúp bạn mau tìm biện pháp khắc phục.
Trần Hoàng Dũng is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Thanked by

Sponsored Links
Old 24-08-06, 19:45   #2
Nguyễn Xuân Hưng
Administrator
 
Nguyễn Xuân Hưng's Avatar
 
Tham gia ngày: Jul 2004
Đến từ: Genetics of Drosophila Immune Response, IBMC, University of Strasbourg
Bài gửi: 2,169
Thanks: 307
Thanked 776 Times in 425 Posts
Bạn kiểm tra lại hóa chất chưa? Sau 1 năm với tình trạng mất điện thường xuyên ở VN thì không gì đảm bảo cả.

Có đối chứng dương không?
__________________
Burning on the ice
Nguyễn Xuân Hưng is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 24-08-06, 22:42   #3
Vũ Hải Chi
Thành viên
 
Vũ Hải Chi's Avatar
 
Tham gia ngày: Jul 2006
Đến từ: world
Bài gửi: 70
Thanks: 3
Thanked 10 Times in 6 Posts
Bác post ảnh điện di ADN tổng số lên em xem cái, chắc tại hóa chất thôi! :D
Vũ Hải Chi is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 25-08-06, 09:28   #4
Trần Hoàng Dũng
Registered Users
Thread starter
 
Trần Hoàng Dũng's Avatar
 
Tham gia ngày: Aug 2004
Bài gửi: 2,036
Thanks: 0
Thanked 37 Times in 32 Posts
có mấy ý sau em cố gắng làm rõ::


01- Khi em nói là thầy hướng dẫn em làm ra kết quả, vậy thì thầy em có làm cùng 1 chủng nấm, 1 gene cần phân lập, một quy trình tách DNA, một PCR protocol????


02- Khi tui làm PCR kô ra, có những bước sau tui sẽ hiệu chỉnh theo thứ tự ưu tiên là:

- Bỏ các hóa chất đang sử dụng, lấy cái mới như nước cất, buffer, dNTP, pha mới primers, nếu vẫn kô ra thì thay luôn enzyme (chú ý enzyme và buffer đi kèm phải tương thích.

- Kô ra nữa thì quay lại DNA, kiểm tra độ tinh sạch bằng cách chạy điện di kô cần có ladder, nếu DNA tinh sạch thì nó ra 1 band sáng như phage lamda, kô có vệt smear đồng thời do OD để coi DNA concentration, nếu cần thiết thì vứt DNA và tách lại, chú ý coi kỹ protocol, ở bước này kô cần chạy PCR mà chỉ cần chạy diện di và do OD để coi DNA có thật sự sạch kô, khi nào thây nó thật sạch hãy quay lại chạy PCR. Cần chú ý là các thông số hóa chất nên xem xét kỹ lưỡng và giữ hằng định thậm chí của primer cũng kô đổi, bạn chỉ nên điều chỉnh DNA concentration thôi.

- Đến đây mà nó vẫn lì lợm kô ra thì bắt đầu hiệu chỉnh PCR programe.Lưu ý rằng PCR programe thường được set up ngay từ đầu dựa trên nhiệt độ Tm của primer mà ta có được. Nếu bạn có máy PCR mà chạy được gradient nhiệt độ là quá tốt, mỗi khoảng cách nửa độ là ok.

- Nếu nó vẫn kô ra nữa thì bạn chịu khó coi lại trình tự primer, đặt lại primer lần thứ 2, thậm chí nếu cần thiết kế lại primer.

- Nếu vẫn kô ra thì có hai hướng giải quyết:

a- báo cáo là gene cần tìm kô có trong genome hoặc nó bị cắt ngắn nên kô chạy PCR được.
b- Dng Westernblot để dò tìm protein của nó để xác lập rằng gene này có tồn tại trong gene hay không, sau đó tách mRNA của nó và chạy PRC ngược, dò tìm trình tự và thiết kế lại primer.

Chút nữa về viết tiếp.
Trần Hoàng Dũng is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 25-09-06, 15:14   #5
Cao Xuân Hiếu
Administrator
 
Cao Xuân Hiếu's Avatar
 
Tham gia ngày: Nov 2004
Đến từ: Gatersleben, Germany
Bài gửi: 1,552
Thanks: 113
Thanked 320 Times in 173 Posts
Trích:
Nguyên văn bởi Trần Hoàng Dũng
- Nếu vẫn kô ra thì có hai hướng giải quyết:

a- báo cáo là gene cần tìm kô có trong genome hoặc nó bị cắt ngắn nên kô chạy PCR được.
b- Dng Westernblot để dò tìm protein của nó để xác lập rằng gene này có tồn tại trong gene hay không, sau đó tách mRNA của nó và chạy PRC ngược, dò tìm trình tự và thiết kế lại primer.

Chút nữa về viết tiếp.
1. Đến cả PCR còn chưa nhân lên để sequencing được thì làm cách nào tiến hành Westernblot đây?

2. Mới chỉ thế mà đã báo cáo gene ko có trong genome thì thật ai dám tin. Cùng lắm là báo cáo tôi đã PCR bằng ? cặp primer trình tự như sau mà ko có sản phẩm thôi.
Cao Xuân Hiếu is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 25-09-06, 17:12   #6
Nguyễn Ngọc Lương
Administrator
 
Nguyễn Ngọc Lương's Avatar
 
Tham gia ngày: Nov 2005
Đến từ: Đại học Huế
Bài gửi: 2,143
Thanks: 157
Thanked 716 Times in 424 Posts
Kể cả khi không lên được PCR hay lên PCR không đúng cái mình cần hoặc Westernblot cho âm tính thì vẫn chưa kết luận được genome không có gene đó. Các bác xem lại cái thí nghiệm về gene điều khiển chu trình tế bào của thằng Paul Nurse được Nobel ấy. Đúng không nhỉ?

"What's more, Lee had already failed to identify the human gene by the more conventional means of hybridization using probes for the pombe gene or using antibodies that recognized the pombe protein"
__________________
Molecular biology is deceptively simple.
Method is everything but the devil is in the detail
Molecular biology and religion have one thing in common: you must have faith in what you can not see
Nguyễn Ngọc Lương is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 26-09-06, 11:50   #7
Nguyễn Ngọc Lương
Administrator
 
Nguyễn Ngọc Lương's Avatar
 
Tham gia ngày: Nov 2005
Đến từ: Đại học Huế
Bài gửi: 2,143
Thanks: 157
Thanked 716 Times in 424 Posts
"Nếu nó vẫn kô ra nữa thì bạn chịu khó coi lại trình tự primer, đặt lại primer lần thứ 2, thậm chí nếu cần thiết kế lại primer"
Chắc bác Dũng bảo Hiếu coi lại cái này chứ không phải là coi lại sách vở. Ý là đặt lại primer mới, thiết kế lại primer...x n lần mà vẫn không ra thì phải chịu thôi --> phương pháp PCR không cho ra kết quả--> tìm phương pháp khác.
Mà không câu ra được gene vẫn chạy Western blot bình thường mà, vì chắc chắn khi câu gene thì gene này phải thuộc họ nào, tính chất thế nào ở các loài khác đã biết rồi, đúng không nhỉ?
__________________
Molecular biology is deceptively simple.
Method is everything but the devil is in the detail
Molecular biology and religion have one thing in common: you must have faith in what you can not see
Nguyễn Ngọc Lương is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 26-09-06, 13:05   #8
Trần Hoàng Dũng
Registered Users
Thread starter
 
Trần Hoàng Dũng's Avatar
 
Tham gia ngày: Aug 2004
Bài gửi: 2,036
Thanks: 0
Thanked 37 Times in 32 Posts
Trích:
Nguyên văn bởi Nguyễn Ngọc Lương
"Nếu nó vẫn kô ra nữa thì bạn chịu khó coi lại trình tự primer, đặt lại primer lần thứ 2, thậm chí nếu cần thiết kế lại primer"
Chắc bác Dũng bảo Hiếu coi lại cái này chứ không phải là coi lại sách vở. Ý là đặt lại primer mới, thiết kế lại primer...x n lần mà vẫn không ra thì phải chịu thôi --> phương pháp PCR không cho ra kết quả--> tìm phương pháp khác.
Mà không câu ra được gene vẫn chạy Western blot bình thường mà, vì chắc chắn khi câu gene thì gene này phải thuộc họ nào, tính chất thế nào ở các loài khác đã biết rồi, đúng không nhỉ?
Cám ơn BS Lương đã hiểu được ý tui và đã nói được 1 ý cực kỳ quan trọng: kô cần đọc trình tự 1 gene vẫn có thể đi dò tìm gene đó trong genome bằng Western blot.
Trần Hoàng Dũng is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 26-09-06, 15:28   #9
Cao Xuân Hiếu
Administrator
 
Cao Xuân Hiếu's Avatar
 
Tham gia ngày: Nov 2004
Đến từ: Gatersleben, Germany
Bài gửi: 1,552
Thanks: 113
Thanked 320 Times in 173 Posts
1. Western blot lấy kháng thể ở đâu? kết quả dương tính hay âm tính thì kết luận ntn?

2. Nếu ko tìm thấy ở gene ở mức độ genomics thì lại tìm ở mức độ sản phẩm của gene liệu có phải "giải pháp" k?
Cao Xuân Hiếu is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 26-09-06, 17:59   #10
Nguyễn Ngọc Lương
Administrator
 
Nguyễn Ngọc Lương's Avatar
 
Tham gia ngày: Nov 2005
Đến từ: Đại học Huế
Bài gửi: 2,143
Thanks: 157
Thanked 716 Times in 424 Posts
Các bác bình tĩnh lại một chút nào. Tôi đã đưa ví dụ của thằng Paul Nurse lên chẳng lẽ các bác không đọc một tí nào à?
Paul Nurse: tìm được gene đ/k chu kỳ ở nấm men, theo nguyên lý reduction sẽ đoán ra là có gene như vậy ở người. Thiết kết mồi PCR, probe...v.v cuối cùng vẫn không tìm thấy. Western blot nó dựa trên các vùng bảo thủ vẫn không tìm thấy (các kháng thể sử dụng cho western blot chủ yếu là dựa trên đặc hiệu trình tự chứ không phải cấu trúc, phải không nhỉ?)...nhưng mấy ông đó không dừng lại mà tiến hành một thí nghiệm rất hay là lấy cDNA của người chuyển vào nấm men, giống bị đột biến chu kỳ tế bào. Kết cục tìm ra được clone có chứa cái gene điều khiển chu kỳ ở cái clone mà sau khi được chuyển cDNA vào thì trở lại chu kỳ tế bào bình thường --> tìm ra cái gene đó ở người.

Tất nhiên kể cả khi có kết quả dương trong lai hoặc blot thì đó chỉ là thêm hy vọng cho chúng ta để làm tiếp thôi. Còn âm thì đương nhiên dễ kết luận hơn.

Dù sao với tầm cỡ các sư sĩ ở Anh mà vẫn cười vào mũi Paul Nurse khi cha này thử làm cái thí nghiệm biến nạp cDNA kia thì có lẽ ở mức độ sinh viên khi chạy RCR đủ kiểu mồi không ra thì có thể báo cáo với thầy là "vô khả thi" được rồi. Và đương nhiên là cái công trình cũng đi tong luôn. Tất nhiên khi làm TS trở lên thì "phải tìm cho ra" vì nói chung cái sách lược reductionsim (cái gì ở con vi khuẩn có thì ở con voi cũng phải có) cho đến nay vẫn đứng vững, vì vậy sẽ phải thay đổi, tìm cách tiếp cận khác.
__________________
Molecular biology is deceptively simple.
Method is everything but the devil is in the detail
Molecular biology and religion have one thing in common: you must have faith in what you can not see
Nguyễn Ngọc Lương is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Trả lời

Ðiều Chỉnh
Xếp Bài

Chuyển đến


vB 3.8.7 Copyright © 2000 - 2017, Jelsoft Enterprises Ltd.