Go Back   Diễn đàn Sinh học Việt Nam > Phòng thí nghiệm > Làm thí nghiệm với acid nucleic

Làm thí nghiệm với acid nucleic Tách chiết, đo OD, điện di, cắt giới hạn, ligation, biến nạp, cloning, blotting...

Trả lời
 
Ðiều Chỉnh Xếp Bài
Old 25-09-06, 15:14   #11
Trịnh Thành Trung
Thread starter
 
Trịnh Thành Trung's Avatar
 
Tham gia ngày: Sep 2006
Đến từ: Institute of Medical Microbiology, Greifswald, Germany
Bài gửi: 279
Thanks: 7
Thanked 28 Times in 16 Posts
Trích:
Nguyên văn bởi Cao Xuân Hiếu
Chắc chắn là ảnh hưởng và làm giảm hiệu suất cắt nếu so sánh với từng enzyme một. Cứ tưởng tượng việc 3 anh cùng một lúc cưa 1 em gái thì phải biết là chiến đấu ác liệt thế nào rồi. Một kinh nghiệm khi cắt nhiều RE cùng 1 tube là phải tăng tổng thể tích (pha loãng) phản ứng RE lên để tránh tỷ phần glycerol trong ống quá cao. Vd. nếu cho tổng 3microl enzyme thì thể tích cắt ít nhất phải 20 -30 microl.


Pp đơn giản gọn nhẹ thì em biết rồi. Bây giờ em muốn pp chính xác hơn thì tất nhiên phải đắt và phức tạp hơn rồi. Anh chỉ ra đây 1 vài stratergy để em lựa chọn cái thích hợp.

1. Kiểm tra xem phản ứng có 100% không (Y/N) ? (ko quan tâm đến con số hiệu suất ?%) Làm 1 cặp mồi giăng 2 đầu của mỗi điểm cắt. Dùng sản phẩm cắt để làm template chạy PCR => có sản phẩm thì là chưa 100%

2. Tính chính xác (cực kỳ) số hiệu suất của từng RE thì dùng qPCR với những cặp primer mục 1 nhưng gắn huỳnh quang. Dựa vào kết quả real time PCR để định lượng template còn sót lại chưa được cắt.

3. Tăng tính chính xác của điện di trên gel agarose => 3.1)  dùng 1 loại dye khác nhạy hơn EtBr; 3.2) chạy trên bản gel acrylamid; 3.3) chạy trên gel acrylamid nhồi trong ống mao quản của máy sequencer hoặc các máy genotyping cùng loại (tính chính xác cao nhưng ko có khả năng định lượng), muốn định lượng thì lại phải dùng 1 phản ứng gắn (hoặc nhuộm) 1 loại dye định lượng vào phân tử DNA

Hiện anh mới chỉ có mấy cái idea đó, nếu em đã sưu tầm được pp nào hay hơn thì bảo anh biết với. Hỏi bọn 4rum Protocols thử xem.
Chân thành cám ơn câu trả lời và ý tưởng của anh Hiếu.
Sau đây tôi xin trinh bày idea của mình. Mời mọi người cùng tham gia và cho ý kiến.

Mở đầu: - Burkhoderia pseudomallei là vi khuẩn gây bệnh melioidosis. Từ lâu, Việt Nam được xem như là một nước nằm trong vùng dịch bệnh xong rất ít các nhà khoa học trong nước biết về căn bệnh này. Do đó, thường chuẩn đoán nhầm sang một số laọi bệnh phổ biến khác.
- Có rất nhiều loại vi khuẩn khác (cùng chi) cùng khư trú trong ổ nhiễm trùng khi bệnh nhân bị nhiễm trùng với vi khuẩn trên.
- Việc phân loại nhanh, chính xác vi khuẩn còn gặp rất nhiều khó khăn (từ phương pháp hóa sinh đơn giản đến phương pháp phức tạp như Real time PCR)

Đặt vấn đề: Năm 2005, các nhà khoa học đã tìm ra cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn recA gene (869 bp) của chi Burkhoderia và sequence để phân loại.
Bằng sử dụng phần mềm Clone manager có chứa 234 loại enzyme giới hạn khác nhau. Tôi đã sàng lọc và lựa chọn được 3 RE có thể cắt tất cả các đoạn recA gene của các loại vi khuẩn có dính líu trong ổ nhiễm trùng nhưng hoàn toàn không cắt đoạn recA gene của vi khuẩn B. pseudomallei.

Giải quyết vấn đề: Từ mẫu bệnh phẩm, sử dụng kĩ thuật tách ADN tổng số, sau đó chạy PCR với với cặp mồi đặc hiệu, rồi sử dụng tổ hợp 3 RE trên để digest sản phẩm PCR, sau đó chạy điện di, nếu trên bản Gel vẫn xuất hiện băng có kính thước 869 bp thì có thể chuẩn đoán bệnh nhân bị dưong tính với vi khuẩn B. pseudomallei.
Để confirm lại kết quả đoạn băng đó có chính xác là B. pseudomallei hay không và từ đó đánh giá cái specificity và efficiency của thí nghiệm.
Thí nghiệm được suy diễn dựa trên sự lai hóa 2 phương pháp: RFLP và AFLP

Kết luận:
- Nếu ta dùng tổ hợp 3 RE cùng một lúc. Với hiệu suất cắt tuyệt vời. Ta có thể chuẩn đoán bệnh melioidosis bằng các kĩ thuật sinh học phân tử đơn giản. Thời gian cho chuẩn đoán mất khoảng 2 ngày (pp hóa sinh mất khoảng 1 tuần, pp real time PCR mất khoảng 1,5 ngày)
Chính vì lẽ đó, đến đây Tôi đã trả lời cho các bạn vì sao Tôi cần hiệu suất cắt là phải' very good'.

To anh Hiếu: chính vì dùng tổ hợp các RE khác nhau, sau khi cắt, nó tạo ra rất nhiều phân đoạn nhỏ (vì nó phải cắt tại nhiều nơi trên đoạn gene, vì vậy Real time PCR có vẻ không khả thi lắm 'vì rất mệt mỏi để dò dò từng phản ứng cắt một trên từng điểm cắt một')
-'Cứ tưởng tượng việc 3 anh cùng một lúc cưa 1 em gái thì phải biết là chiến đấu ác liệt thế nào rồi'. Do tính đặc hiệu, RE chỉ nhận biết các đoạn đặc hiệu trên gene và cắt tại các điểm đó. Chính vì thế, trong ý này, Em hiểu là 3 Anh em ta cưa 3 cô gái khác nhau. Em chỉ sợ một điều rằng, trên đường đi tán gái, cả 3 anh em ta đều đâm phải nhau, phải dừng lại để giải quyết, và đến nhà các cô gái chậm hơn so với dự định.
- 'Một kinh nghiệm khi cắt nhiều RE cùng 1 tube là phải.... ' Đây chính là trọng tâm câu hỏi của em. Anh đã đọc được protocol nào dùng nhiều RE cho 1 tube chưa??? Nếu rồi, Anh có thể gửi cho em được không???
- 'dùng 1 loại dye khác nhạy hơn EtBr' Anh tiếp tục gợi ý cho em phát này đi và nếu có thể Anh có thể cho em biết cái minimum của nồng độ băng trên bản gel (bao nhiêu ng???)
- 'Hỏi bọn 4rum Protocols thử xem' Em muốn trước tiên chia sẻ kinh nghiệm nghiên cứu với Anh em nhà trước đã. Sau đó em sẽ hỏi bọn trên diễn đàn này.

To everyone: Các bạn nào có nhiều kinh nghiệm trong AFLP đặc biệt trong gian đoạn sử dụng RE hoặc quen biết ai làm chuyên gia trong lĩnh vực này thì giúp Tôi giải bài toán trên với.

P/S: Tôi là người luôn luôn thích thực nghiệm và rất nghét những ai chỉ ôm khư khư lí thuyết nhưng chẳng có gì trong thực nghiệm cả. Hơn nữa, Tôi cũng không cần ai đó phải đem lí thuyết ra để bảo Tôi vì trước khi hỏi cái gì Tôi cũng đã tìm hiểu lí thuyết về nó rồi. Cái tôi cần là thực nghiệm và ý tưởng trong nghiên cứu cùng với những lời gợi ý chân thành. Bài toán của Tôi đặt ra là hoàn toàn có ý nghĩa trong thực tế và không có gì gọi là thách đố những người trong lĩnh vực chuyên môn đó. Ý tưởng đó không xấu như một số người đã nghĩ.
Trịnh Thành Trung is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 25-09-06, 15:20   #12
Trịnh Thành Trung
Thread starter
 
Trịnh Thành Trung's Avatar
 
Tham gia ngày: Sep 2006
Đến từ: Institute of Medical Microbiology, Greifswald, Germany
Bài gửi: 279
Thanks: 7
Thanked 28 Times in 16 Posts
Trích:
Nguyên văn bởi Trịnh Thành Trung

Để confirm lại kết quả đoạn băng đó có chính xác là B. pseudomallei hay không và từ đó đánh giá cái specificity và efficiency của thí nghiệm.
Sorry. xin bổ sung thêm
...... Thì Tôi đã biết phương pháp và chúng ta không phải bàn cãi về vấn đề này.
Trịnh Thành Trung is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 25-09-06, 16:27   #13
Trần Hoàng Dũng
Registered Users
 
Trần Hoàng Dũng's Avatar
 
Tham gia ngày: Aug 2004
Bài gửi: 2,036
Thanks: 0
Thanked 37 Times in 32 Posts
Một tên tội phạm lẫn sống lẫn trong một vùng dân cư, sau một hồi tra cứu, thám tử của Sở cảnh sát phát hiện là tên tội phạm có đặc điểm là mình đồng da sắt tức là đạn bắn không thủng. Hiện nay có N khu dân cư bị tình nghi có chứa tội phạm. Làm sao tìm tên tội phạm?

Giải pháp đề xuất: đem toàn bộ dân làng của từng khu dân cư ra bắn bỏ, làng nào chết sạch sẽ thì kết luận làng đó kô có chứa tên tội phạm, còn làng nào còn người sống thì kết luận là làng đó có chứa tên tội phạm.

Yêu cầu bài toàn: tìm biện pháp sao cho súng đạn của cảnh sát từ súng lục cho đến đại bác hoạt động tối ưu tức là bắn chết toàn bộ dân làng với hiệu suất 100% dân làng phải chết.

Hay đấy chứ nhỉ!!!!!
Trần Hoàng Dũng is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 25-09-06, 16:57   #14
Nguyễn Xuân Hưng
Administrator
 
Nguyễn Xuân Hưng's Avatar
 
Tham gia ngày: Jul 2004
Đến từ: Genetics of Drosophila Immune Response, IBMC, University of Strasbourg
Bài gửi: 2,169
Thanks: 307
Thanked 776 Times in 425 Posts
Trích:
'dùng 1 loại dye khác nhạy hơn EtBr' Anh tiếp tục gợi ý cho em phát này đi và nếu có thể Anh có thể cho em biết cái minimum của nồng độ băng trên bản gel (bao nhiêu ng???)
Cái này có thể đọc tài liệu hoặc google được mà.
__________________
Burning on the ice
Nguyễn Xuân Hưng is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 25-09-06, 17:04   #15
Nguyễn Ngọc Lương
Administrator
 
Nguyễn Ngọc Lương's Avatar
 
Tham gia ngày: Nov 2005
Đến từ: Đại học Huế
Bài gửi: 2,143
Thanks: 157
Thanked 716 Times in 424 Posts
Sao không thử xài các phương pháp khác như nested PCR, lai (thiết kế probe đặc hiệu vào)...v.v nhỉ? Nếu những phương pháp này không đảm bảo độ chính xác 100% thì phương pháp cắt của bạn có lẽ cũng không thể chính xác hơn chúng. Đúng là về thực nghiệm thì ở đây chỉ có vài người làm nhưng có lẽ góp ý về cái design của bạn thì chắc có nhiều người góp ý được đấy.
Bác Dũng dùng analog cũng hay đấy chứ: tìm một tên tội phạm mà phải bắn chết tất cả những người vô tội - bên toán họ làm ngược lại như vậy - gọi là chứng minh phản chứng - khỏe hơn nhiều.
To bạn Trung: bác Dũng có giọng văn hơi "gai" và "chua" một chút. Đừng để ý đến những chuyện đó mà nên khai thác kinh nghiệm của bác ấy. Có lẽ kinh nghiệm thực nghiệm của bác ấy cũng không ít đâu (sau gần chục năm chinh chiến trời Âu).
Bạn vẫn có thể post ở Molecular biology forum hoặc Protocol online để xem người ta có ý kiến gì không? Các chỗ đó "chuyên gia" hơn chỗ này. Nhưng theo tôi bạn nên viết luôn cái experiment design của mình để bọn nó góp ý xem có practically feasible không cái đã.
__________________
Molecular biology is deceptively simple.
Method is everything but the devil is in the detail
Molecular biology and religion have one thing in common: you must have faith in what you can not see
Nguyễn Ngọc Lương is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 25-09-06, 19:34   #16
Trần Hoàng Dũng
Registered Users
 
Trần Hoàng Dũng's Avatar
 
Tham gia ngày: Aug 2004
Bài gửi: 2,036
Thanks: 0
Thanked 37 Times in 32 Posts
Trích:
Nguyên văn bởi Nguyễn Ngọc Lương
Bác Dũng dùng analog cũng hay đấy chứ: tìm một tên tội phạm mà phải bắn chết tất cả những người vô tội - bên toán họ  làm ngược lại như vậy - gọi là chứng minh phản chứng - khỏe hơn nhiều.
Đúng, bài toán dò tìm  1 con VSV đặc hiệu trong 1 quần thề VSV chẳng có gì là lạ, bình thường nữa là khác, cách của BS Lương có thể là 1 trong những cách có thể nghĩ tới. Hơn nữa nếu đọc qua giáo trình Phương pháp luận sáng tạo sẽ thấy người ta được khuyến khích tự do đề ra hàng tá pp cho 1 bài toán. Tuy vậy điều quan trọng là chọn ra được các pp có thể dùng được thì quả là kô dễ, nó đòi hỏi cái gì thì chắc BS Lương cũng biết rồi.
Trần Hoàng Dũng is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 26-09-06, 00:27   #17
Trần Hoàng Dũng
Registered Users
 
Trần Hoàng Dũng's Avatar
 
Tham gia ngày: Aug 2004
Bài gửi: 2,036
Thanks: 0
Thanked 37 Times in 32 Posts
Trích:
Sau đây tôi xin trinh bày idea của mình. Mời mọi người cùng tham gia và cho ý kiến.

Mở đầu: - Burkhoderia pseudomallei là vi khuẩn gây bệnh melioidosis. Từ lâu, Việt Nam được xem như là một nước nằm trong vùng dịch bệnh xong rất ít các nhà khoa học trong nước biết về căn bệnh này. Do đó, thường chuẩn đoán nhầm sang một số laọi bệnh phổ biến khác.
- Có rất nhiều loại vi khuẩn khác (cùng chi) cùng khư trú trong ổ nhiễm trùng  khi bệnh nhân bị nhiễm trùng với vi khuẩn trên.
- Việc phân loại nhanh, chính xác vi khuẩn còn gặp rất nhiều khó khăn (từ phương pháp hóa sinh đơn giản đến phương pháp phức tạp như Real time PCR)
Tên la tinh kô viết nghiêng;
xong sửa thành (st) song;
chuẩn đoán st chẩn đoán;
laọi  lỗi đánh máy, kô cần sửa;
xài tiếng Anh không cần thiết.


Trích:
Đặt vấn đề: Năm 2005, các nhà khoa học đã tìm ra cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn recA gene (869 bp) của chi Burkhoderia sequence để phân loại.
Mồi thì kô phải tìm mà phải do con người thiết kế và tạo ra chứ nó không có sẵn để mà tìm ra; lẫn tạp từ tiếng Anh một cách không cần thiết;
recA gene  st gene recA (sai vị trí và quy cách viết tên gene)

Trích:
Bằng sử dụng phần mềm Clone manager có chứa 234 loại enzyme giới hạn khác nhau. Tôi đã sàng lọc và lựa chọn được 3 RE có thể cắt tất cả các đoạn recA gene của các loại vi khuẩn có dính líu trong ổ nhiễm trùng nhưng hoàn toàn không cắt đoạn recA gene của vi khuẩn B. pseudomallei.
Câu viết sai ngữ pháp; viết sai quy cách tên gene, tên khoa học.

st

Bằng cách sử dụng phần mềm Clone manager có chứa 234 loại enzyme giới hạn khác nhau, tôi đã sàng lọc ...

Giải quyết vấn đề: Từ mẫu bệnh phẩm, sử dụng kĩ thuật tách ADN tổng số, sau đó chạy PCR với với cặp mồi đặc hiệu, rồi sử dụng tổ hợp 3 RE trên để digest sản phẩm PCR, sau đó chạy điện di, nếu trên bản Gel vẫn xuất hiện băng có kính thước 869 bp thì có thể chuẩn đoán bệnh nhân bị dưong tính với vi khuẩn B. pseudomallei.

Lẫn tạp từ tiếng Anh một cách không cần thiết, viết hoa kô đúng chỗ.

Trích:
Để confirm lại kết quả đoạn băng đó có chính xác là B. pseudomallei hay không và từ đó đánh giá cái specificity efficiency của thí nghiệm.
Lẫn tạp từ tiếng Anh một cách không cần thiết, câu mơ hồ.

Thí nghiệm được suy diễn dựa trên sự lai hóa 2 phương pháp: RFLP và AFLP

Sử dụng dấu (:) sai chỗ, dùng sai từ suy diễn trong ngữ cảnh này.


Kết luận:
-
Trích:
Nếu ta dùng tổ hợp 3 RE cùng một lúc. Với hiệu suất cắt tuyệt vời. Ta có thể chuẩn đoán bệnh melioidosis bằng các kĩ thuật sinh học phân tử đơn giản. Thời gian cho chuẩn đoán mất khoảng 2 ngày (pp hóa sinh mất khoảng 1 tuần, pp real time PCR mất khoảng 1,5 ngày)

Sai cơ bản ngữ pháp

st


Nếu ta dùng tổ hợp 3 RE cùng một lúc, với hiệu suất cắt tuyệt vời, ta có thể chẩn đoán bệnh melioidosis bằng các kĩ thuật sinh học phân tử đơn giản. Thời gian cho chẩn đoán mất khoảng 2 ngày (pp hóa sinh mất khoảng 1 tuần, pp real time PCR mất khoảng 1,5 ngày).


Trích:
Chính vì lẽ đó, đến đây Tôi đã trả lời cho các bạn vì sao Tôi cần hiệu suất cắt là phải' very good'.
Viết hoa sai chỗ, dùng sai từ "very good" trong ngữ cảnh này

=====================================

Miễn bình luận, còn anh chị nào thấy lỗi nữa kô, xin mời ạ!
Trần Hoàng Dũng is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Old 26-09-06, 15:57   #18
Trịnh Thành Trung
Thread starter
 
Trịnh Thành Trung's Avatar
 
Tham gia ngày: Sep 2006
Đến từ: Institute of Medical Microbiology, Greifswald, Germany
Bài gửi: 279
Thanks: 7
Thanked 28 Times in 16 Posts
Trời ơi.

- Hãy ngâm cứu lại từ Ph.D. Đừng để rơi vào trạng thái tư tưởng như vô số các tiến sĩ ở chế độ cũ có khả năng đọc thuộc lòng rất nhiều kinh sử nhưng chẳng biết cách vận dụng kinh sử vào thực tiễn gì cả
- 10 năm sống ở châu Âu, trên đất nước Đức, một đất nước có thành tựu khoa học kĩ thuật tiên tiến thuộc dạng sừng sỏ của thế giới. Nơi mà con người được sống và học tập theo phương thức chuyên hóa trong lao động và sản xuất. Thế mà chẳng biết cách học hỏi tí nào về tác phong công nghiệp ấy.

Ở bên châu Âu, Nếu một ông giáo sư chuyên nghành A, mà cậu sinh viên học chuyên ngành B lại hỏi ông ấy vài câu về chuyên ngành B. Các bạn có biết ông giáo sư sẽ nói nào không??? Thứ nhất: Tôi không biết, thứ hai: Thằng này bị điên hay sao mà lại hỏi mình câu đó???

Bản thân tôi, hiện tại chuyên nghành tôi đang theo là Vi sinh Y hoc. Nếu ai đó hỏi Tôi trong lĩnh vực này mà Tôi không biết, đó chính là lỗi của Tôi. Nhưng nếu ai hỏi Tôi về chuyên nghành khác xa với chuyên nghành này, Tôi sẽ bảo người đó là đồ dở hơi......Nếu Tôi biết sơ qua về chuyên ngành của người hỏi. Tôi có thể trả lời theo kiểu của Tôi (vì không có tài liệu trích dẫn). Trong tiếng Anh, người ta gọi là: I dont know but I think.......  

Đừng nghĩ là: đã là Ph.D thì phải biết tất cả, hãy phải biết động não theo đúng tư duy của từ Ph.D để trả lời câu hỏi của người đặt ra.

Tôi vẫn tâm niệm mãi câu nói về các nhà nghiên cứu khoa học: Khoa học là gi??? Khoa học là cái mà con người ta tự đào cho mình một cái hố rồi chôn mình xuống cái hố đó. Nếu ai mà giỏi thì người đó sẽ đào được cái hố sâu và chôn sâu mình xuống dưới đó, rất ít người đương thời có thể biết về họ nhưng cái giá trị thực tiễn trong công trình nghiên cứu của họ thì rất nhiều người ở thế hệ sau biết được. Còn nếu ai mà không nổi tự đào cho mình cái hố để đủ chôn mình xuống, vẫn còn để thò cái đầu ngoe nguẩy ở phía trên thì rất nhiều người đương thời biết đến nhưng sau đó cũng chỉ là những trò lố lăng để lại cho đời sau.

Tôi thì cũng chẳng biết nói thế nào hơn nữa, nhưng hãy về vắt tay lên trán mà nghĩ lại cái ý nghĩa của từ Ph.D và cố gắng học tập theo nó.

Thân ái
Trịnh Thành Trung is offline   Trả Lời Với Trích Dẫn
Trả lời

Ðiều Chỉnh
Xếp Bài

Chuyển đến

Similar Threads
Ðề tài Người gửi Chuyên mục Trả lời Bài mới gởi
Tủa enzyme bằng cồn hay muối Nguyễn Duy Hưng Làm thí nghiệm với protein 4 24-03-16 11:01
Tìm bài báo về ứng dụng của enzyme Nguyễn Ngọc Lương Tài liệu theo yêu cầu 5 30-06-08 21:07
Enzyme về Công nghệ môi trường!!! Thành viên cũ Những vấn đề thực nghiệm khác 2 26-10-06 21:31
Sản xuất enzyme Lê Đoàn Thanh Lâm Làm thí nghiệm với protein 1 02-03-06 19:51


vB 3.8.7 Copyright © 2000 - 2017, Jelsoft Enterprises Ltd.