Diễn đàn Sinh học Việt Nam

Diễn đàn Sinh học Việt Nam (http://www.sinhhocvietnam.com/forum/index.php)
-   Làm thí nghiệm với acid nucleic (http://www.sinhhocvietnam.com/forum/forumdisplay.php?f=14)
-   -   Kỹ thuật điện di- thực nghiệm (http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=351)

Nguyễn Xuân Hưng 23-04-05 15:44

Kỹ thuật điện di- thực nghiệm
 
Tôi thấy diễn đàn trong thời gian vừa qua đã bàn đến rất nhiều vấn đề lý thuyết. Theo tôi nên chăng chúng ta sẽ đi vào các vấn đề thực nghiệm. Qua đó rút ra phương pháp làm thí nghiệm tối ưu trong từng điều kiện.

Bắt đầu từ những kỹ thuật đơn giản nhất.

Theo bạn, trong kỹ thuật điện di DNA dùng gel agarose nên

1. Nên đổ gel ở bao nhiêu độ C?

2. Dùng một lượng DNA là bao nhiêu (thể tích, nồng độ) đối với sản phẩm PCR, với Plasmid, với DNA genome?

3. Nạp mẫu vào giếng khi chưa đặt gel vào dung dịch đệm hay khi đã đặt gel vào bể điện di?

4. Marker (ladder) nên đặt ở giếng đầu tiên, giếng cuối cùng, giếng giữa hay cả đầu và cuối?

5. Điện di ở bao nhiêu Vôn, bao nhiêu Ampe ứng với từng loại DNA?

6. Nên pha ethidium bromide vào dung dịch đệm hay điện di xong rồi nhuộm?

Trần Hoàng Dũng 24-04-05 02:57

tôi làm theo prôtcol phù hợp công việc đang tiến hành.

Cao Xuân Hiếu 24-04-05 05:08

có nhiều trường hợp, do đối tượng nghiên cứu đặc biệt, cũng như mục đích nghiên cứu khác nhau mà tự mình phải "chế biến" lại protocol. Và khi đấy cũng cần phải biết cái gì là giới hạn cho phép của các biến đổi.

Casper cứ tiếp tục đê.

1. Gel đổi ở 60oC. Đấy là kinh nghiệm của mọi ng ở đây. Họ giữ agarose đã pha với EtBr tại các tủ ấm 60oC. Khi nào cần đổ gel thì lôi ra dùng luôn. Khỏi mất công đun nóng, để nguội. Chỉ lưu ý là khá tốn điện :) nếu công suất làm việc ko cao.

Nguyễn Xuân Hưng 24-04-05 08:40

Trích:

1. Gel đổi ở 60oC. Đấy là kinh nghiệm của mọi ng ở đây. Họ giữ agarose đã pha với EtBr tại các tủ ấm 60oC. Khi nào cần đổ gel thì lôi ra dùng luôn. Khỏi mất công đun nóng, để nguội. Chỉ lưu ý là khá tốn điện nếu công suất làm việc ko cao.
Đây là một kinh nghiệm hay, nhưng có một vấn đề là nếu để lâu thì phải chống bay hơi. Với lại gel pha sẵn với EtBr nên lúc đổ phải cẩn thận chút, chạy xong phải vệ sinh thiết bị cẩn thận chút. Tôi thấy ở điều kiện VN nên nhuộm EtBr sau khi điện di xong thì hơn.

Theo cách ở chỗ anh Vietbio tôi thấy ở các phòng thí nghiệm VN nên chăng làm hẳn một cái phòng lạnh nhỏ 4oC, cho các thiết bị ly tâm, để một số hoá chất, mẫu vào đó. Tuy hơi tốn điện và phải mất công đầu tư thêm cái phòng lạnh nhưng lại tiết kiệm được không phải mua tủ lạnh và máy ly tâm lạnh (máy thường để ở 4oC thì có khác gì :mrgreen: ).

2.
Trích:

tôi làm theo prôtcol phù hợp công việc đang tiến hành.
3. Trước đây tôi thường nạp mẫu khi đã đặt gel vào bể điện di nhưng bây giờ thì toàn nạp khô thôi (đổ gel, chờ khô, nạp mẫu rồi đặt vào bể điện di).

Dương Văn Cường 24-04-05 11:20

Trích:

1. Gel đổi ở 60oC. Đấy là kinh nghiệm của mọi ng ở đây. Họ giữ agarose đã pha với EtBr tại các tủ ấm 60oC. Khi nào cần đổ gel thì lôi ra dùng luôn. Khỏi mất công đun nóng, để nguội.
Cái này cũng là một điều hay vì giữ liên tục ở 60 độ C sẽ làm cho chất lượng gel ổn định hơn. Cách làm hiện nay của Phòng thí nghiệm chỗ tôi làm là mỗi lần đổ gel phải đun bằng lò vi sóng không tốt vì bản gel đổ lúc đầu (mới pha xong) và lúc cuối (gần hết lọ) thường không được như những bản đổ lúc giữa. Lúc mới pha xong mặc dù đun tới 3 - 4 phút vẫn chưa đều (kinh nghiệm bản thân) và lúc cuối thường là quá đặc (kinh nghiệm nhiều người).

Trích:

2. Dùng một lượng DNA là bao nhiêu (thể tích, nồng độ) đối với sản phẩm PCR, với Plasmid, với DNA genome?
Cái này thì thực sự phụ thuộc thí nghiệm.

Trích:

3. Nạp mẫu vào giếng khi chưa đặt gel vào dung dịch đệm hay khi đã đặt gel vào bể điện di?
Cái này cũng là 1 cách hay casper nhể :D . Tớ cũng thử rồi. Với mẫu bình thường check chiếc thì không quan trọng lắm, nhưng lúc thôi gel có khi rất hữu ích. Có lần tớ thôi gel, tra mẫu vào xong nó phọt hết lên vì lượng loading buffer không đủ để kéo lượng DNA lớn (30 microlitre) xuống. Có lần giếng thủng :mrgreen: toi luôn. Nếu tra mẫu ở ngoài có thể lấy lại được mẫu và nói chung dễ xử lý hơn nếu có sự cố.

Trích:

5. Điện di ở bao nhiêu Vôn, bao nhiêu Ampe ứng với từng loại DNA?
Tớ luôn đặt cố định 100v (lúc nào vội thì đặt 110), tăng mA lên tối đa (300mA). Làm nhưng cũng chẳng hỏi tại sao lại là 100v.

Nguyễn Xuân Hưng 25-04-05 08:47

Trích:

Cách làm hiện nay của Phòng thí nghiệm chỗ tôi làm là mỗi lần đổ gel phải đun bằng lò vi sóng không tốt vì bản gel đổ lúc đầu (mới pha xong) và lúc cuối (gần hết lọ) thường không được như những bản đổ lúc giữa. Lúc mới pha xong mặc dù đun tới 3 - 4 phút vẫn chưa đều (kinh nghiệm bản thân) và lúc cuối thường là quá đặc (kinh nghiệm nhiều người).
Đúng rồi, có một cách đun mà vẫn tránh được tình trạng này đó là trước khi đun bạn đem cân cái lọ lên, đun xong đem cân lại và bổ sung nước cất cho đến trọng lượng ban đầu. Như vậy sau mỗi lần đun gel sẽ không bị đặc lại. Nhược điểm là mất thời gian quá, nên tớ cũng chả chịu làm :mrgreen: .

Trích:

Cái này cũng là 1 cách hay casper nhể . Tớ cũng thử rồi. Với mẫu bình thường check chiếc thì không quan trọng lắm, nhưng lúc thôi gel có khi rất hữu ích. Có lần tớ thôi gel, tra mẫu vào xong nó phọt hết lên vì lượng loading buffer không đủ để kéo lượng DNA lớn (30 microlitre) xuống. Có lần giếng thủng toi luôn. Nếu tra mẫu ở ngoài có thể lấy lại được mẫu và nói chung dễ xử lý hơn nếu có sự cố.
Cái này là thấy ông ở Pháp về làm thế, bắt chước cũng thấy hay. Có vấn đề là lúc đặt gel vào bể điện di phải cẩn thận không có mẫu trào hết ra ngoài.

Một nhược điểm của việc nạp mẫu khi đặt gel trong bể điện di (có dung dịch đệm) là trong giếng điện di đã có sẵn dung dịch đệm nên khi ta nạp mẫu, mẫu sẽ bị pha loãng ra hơn nhiều so với phương pháp kia. Chưa kể mẫu của ta phải chiến đấu với bọn đệm có từ trước trong giếng để đuổi chúng ra.

Cao Xuân Hiếu 25-04-05 14:52

Trích:

Nguyên văn bởi casper
Trích:

Cái này cũng là 1 cách hay casper nhể . Tớ cũng thử rồi. Với mẫu bình thường check chiếc thì không quan trọng lắm, nhưng lúc thôi gel có khi rất hữu ích. Có lần tớ thôi gel, tra mẫu vào xong nó phọt hết lên vì lượng loading buffer không đủ để kéo lượng DNA lớn (30 microlitre) xuống. Có lần giếng thủng toi luôn. Nếu tra mẫu ở ngoài có thể lấy lại được mẫu và nói chung dễ xử lý hơn nếu có sự cố.
Cái này là thấy ông ở Pháp về làm thế, bắt chước cũng thấy hay. Có vấn đề là lúc đặt gel vào bể điện di phải cẩn thận không có mẫu trào hết ra ngoài.

Một nhược điểm của việc nạp mẫu khi đặt gel trong bể điện di (có dung dịch đệm) là trong giếng điện di đã có sẵn dung dịch đệm nên khi ta nạp mẫu, mẫu sẽ bị pha loãng ra hơn nhiều so với phương pháp kia. Chưa kể mẫu của ta phải chiến đấu với bọn đệm có từ trước trong giếng để đuổi chúng ra.

Tôi thấy có vẻ kinh nghiệm này chỉ là cảm tính. Việc bạn load mẫu vào giếng thì chuyện hòa loãng mẫu là tất yếu. Khi đấy cái quan trọng là bạn có bao nhiêu ng DNA ở mỗi giếng chứ đâu phải là nồng độ :evil:

Bạn load mẫu vào khi để bản gel ở ngoài thì chẳng qua cũng như 1 bước cô đặc mẫu (giảm thể tích) vì loading buffer của bạn sẽ phải thấm vào giếng và làm ẩm gel agarose thôi. Bạn đặt gel đã load mẫu vào dung dịch đệm mà để ộc hết mẫu ra khỏi giếng thì chẳng còn giá trị gì.

Khi load mẫu vào giếng đặt trong bể điện di thì DNA do đã hình thành liên kết yếu với bromphenol blue nên lắng nhanh xuống đáy giếng, chẳng ai phải đánh đuổi ai cả.

Cái quan trọng là lượng DNA tối đa có thể đưa mẫu vào 1mm giếng là bao nhiêu? Đã có ai điện di để thôi gel mà bản điện di không chạy trong khi bọt khí sôi sùng sục chưa?

Nguyễn Xuân Hưng 26-04-05 08:11

Trích:

Tôi thấy có vẻ kinh nghiệm này chỉ là cảm tính
Có thể, quan trọng là khi làm thì thấy tiện lợi hơn nhiều. Nhất là có thể nhìn rõ giếng. Hơn nữa nếu khi điện di rất nhiều giếng, có thể dùng pipet nhiều đầu để tra mẫu một cách dễ dàng hơn khi đã đặt trong đệm.

Trích:

Bạn đặt gel đã load mẫu vào dung dịch đệm mà để ộc hết mẫu ra khỏi giếng thì chẳng còn giá trị gì
Thế nên đã có chú ý là cẩn thận. Quan trọng là theo cách làm này thì nhiều cái lợi hơn cái hại.

Vũ Anh Tuấn 06-05-05 20:45

Tôi đổ khoảng vài bản gel cùng một lần, ngâm trong TBE 0.5 hoặc 1X (tủ lạnh 4 độ), dùng vô tư trong vòng 1 đến 2 tháng, ko thấy ảnh hương gì cả.
Lưu ý lượng DNA chạy, nếu nhiều quá thì đổ gel đầy lên, ko có gì qua phức tạp.

sv_ngheo 10-05-05 13:36

Trích:

Khi load mẫu vào giếng đặt trong bể điện di thì DNA do đã hình thành liên kết yếu với bromphenol blue nên lắng nhanh xuống đáy giếng, chẳng ai phải đánh đuổi ai cả.
Bây giờ mới biết là Bromophenol blue (biết đâu lại cả cylenxyanol) có cái chức năng kéo mẫu xuống . vẹtBio ơi, cái này hay à nha !!!!! chuyện lạ à nha !!!!!! phét minh mới à nha !!!!!!!!


Từ thuở biết cầm pippet tới giờ chỉ biết có succrose, glycerol .. có cái chức năng ấy thôi !!!


Mình phải xem lại kiến thức của mình mới được !!!!!!!!!


Múi giờ GMT. Hiện tại là 03:18.

vB 3.8.7 Copyright © 2000 - 2017, Jelsoft Enterprises Ltd.